Guía completa de soluciones de extracción de ADN

La extracción de ADN es un proceso fundamental en la biología molecular, la genética y diversos campos de la investigación biológica. Debemos reconocer la importancia de lograr una extracción de ADN de alta calidad. Implica el aislamiento de ADN de células o tejidos para análisis posteriores, como PCR, secuenciación de ADN u otras técnicas moleculares. Este artículo no solo cubrirá los conceptos básicos de extracción de ADN, preparación de plásmidos y equipos de aislamiento de ADN. También le ayudará a aumentar su productividad al recomendar mejores técnicas de purificación para las diferentes necesidades de extracción, de modo que dedique menos tiempo a extraer ADN.

¿Qué es el aislamiento de ADN?

El aislamiento de ADN, también conocido como extracción de ADN, consiste en obtener ADN de alta pureza a partir de muestras biológicas como células, tejidos u organismos. Es un paso fundamental en muchos estudios experimentales, y sólo después de que se haya extraído el ADN con alta calidad se podrá continuar con la investigación y el análisis. La extracción de ADN es importante en genética, ciencia forense, genómica en PCR, toma de huellas dactilares de ADN y secuenciación de ADN.

El aislamiento de ADN es un paso crítico en muchas áreas de la biología y la biología molecular porque la calidad y pureza del ADN aislado pueden afectar significativamente el éxito de experimentos y análisis posteriores. La selección de métodos y reactivos de extracción de ADN adecuados es esencial para garantizar la fiabilidad de las muestras de ADN. Es un paso fundamental en diversos campos de la biología y la investigación molecular, incluida la genética, la genómica, la ciencia forense y la biotecnología. Puede utilizar ADN aislado para diversas aplicaciones, incluida la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la secuenciación de ADN, la toma de huellas dactilares de ADN y el análisis genético.

Pasos básicos para la extracción de ADN

Después de recolectar el material biológico que contiene el ADN objetivo, las células se precipitan usando una centrífuga. Esto facilitará el siguiente paso de la extracción de ADN. Los pasos de la purificación del ADN se pueden clasificar en términos generales en los cinco pasos siguientes:

Lisis:

El primer paso en cualquier reacción de purificación de ácidos nucleicos es lisar el material biológico que contiene ADN/ARN. El objetivo de la lisis es alterar rápidamente la membrana celular o tisular y luego todos los componentes dentro de la célula se liberan en el lisado, incluido el ADN. Cuatro métodos estándar para lisar materiales biológicos son químico, físico, enzimático y combinado.

Método	Característica	Tipo de experimento
Interrupción mecánica	La separación mediante homogeneizador o ultrasonidos es adecuada para muestras duras, como células vegetales con paredes celulares fuertes o bacterias. Por supuesto, para muestras muy duras, es necesario triturar la muestra hasta convertirla en polvo con un molinillo.	Adecuado para extracciones aproximadas, como muestreo de ADN ambiental, extracción de ADN del suelo y extracción de ADN para tipos de muestras especializados.
Lisis alcalina	La lisis alcalina es el método químico más utilizado para lisar células. Se aplica a materiales biológicos que se lisan fácilmente, como bacterias y hongos cultivados en tejidos, así como células animales y vegetales. Utiliza principalmente soluciones alcalinas (como SDS y NaOH) para alterar las membranas celulares y desnaturalizar las proteínas.	Experimentos generales de biología molecular como PCR, secuenciación de ADN y huellas dactilares de ADN.
Digestión de proteinasa K	Los métodos enzimáticos son un método muy suave de escisión del ADN y los tratamientos enzimáticos comunes incluyen lisozima, lisozima y proteinasa K, lipasa, colagenasa y lipasa. Los tratamientos enzimáticos son adecuados para el procesamiento de alto rendimiento de una variedad de muestras, incluidas células y tejidos, aunque su uso puede ser un poco más costoso.	Extracción de ADN a partir de muestras de sangre o tejido y purificación de ácidos nucleicos. Adecuado para experimentos que requieren una alta pureza del ADN.

Eliminación de proteínas:

Después de la lisis, debemos separar el ADN de la solución y utilizar una centrífuga para eliminar los lisados. Se eliminan proteínas, azúcares o lípidos de la solución ajustando la velocidad de la centrífuga y el tiempo de centrifugación. Los instrumentos recomendados a utilizar se enumeran a continuación:

Instrumento	Característica	Tipo de experimento
Centrífugo	Ventajas: Separación rápida y eficiente de diferentes componentes en solución, como ADN, proteínas y restos celulares. Adecuado para una amplia gama de tipos y tamaños de muestras. Contras: Requiere equipo especializado. Por lo general, se requiere una cierta cantidad de muestra para llenar el rotor de la centrífuga.	Adecuado para lisis celular, extracción de ADN, precipitación de ADN y pasos de purificación.
Tubos de centrífuga	Ventajas: Pasos de centrifugación rutinarios fáciles de manejar. Adecuado para una amplia gama de tipos de muestras. Contras: Operación manual, requiere algunas habilidades de laboratorio。	Adecuado para centrifugación, partición de muestras, cromatografía en columna y otros pasos de separación.
Aparato de extracción de fenol/cloroformo	Se trata de una separación química que implica el uso de disolventes orgánicos fenol y cloroformo para separar ADN, ARN y proteínas. Ventajas: Puede separar eficazmente ADN, ARN y proteínas. Puede eliminar una amplia gama de contaminantes. Contras: Utiliza compuestos orgánicos que son volátiles y tóxicos. Requiere un manejo cuidadoso.	Adecuado para el aislamiento de ADN, ARN y proteínas, especialmente para la purificación precisa de ácidos nucleicos.
Columnas de purificación de ADN	Ventajas: Proporciona captura y purificación de ADN altamente selectiva. Facilita la extracción de ADN de alto rendimiento. Contras: Mayor costo.	Adecuado para extracción y purificación de ADN comercial o de alto rendimiento, por ejemplo, a partir de sangre, tejido o cultivo celular.
Dispositivo de separación de cuentas magnéticas	Ventajas: Altamente selectivo, puede usarse para capturar ADN o ARN. Adecuado para extracción de ADN de alto rendimiento. Contras: Precio más alto.	Adecuado para extracción de ADN o ARN de alto rendimiento y purificación de ácidos nucleicos.

Cada tipo de equipo tiene sus beneficios y ámbito de aplicación únicos, y la elección exacta depende del propósito, el tamaño y el tipo de muestra del experimento. Algunos experimentos pueden requerir varios pasos, combinando diferentes equipos para una extracción y purificación óptimas del ADN.

Precipitación:

Se requiere un paso de precipitación para separar el ADN de los demás componentes de la solución. Implica la adición de sal y alcohol (generalmente etanol o isopropanol) para precipitar el ADN de la solución. El ADN forma partículas visibles de color blanco o turbias, mientras que los contaminantes permanecen en la fase líquida.

Sin embargo, estos químicos pueden afectar la efectividad y pureza de la precipitación del ADN. Por lo tanto, la precipitación del ADN debe optimizarse de acuerdo con los requisitos experimentales y las características de la muestra, y las condiciones operativas deben controlarse estrictamente.

	Característica	Usar
Centrífugo	Ventajas: Separación eficiente: No se agregan productos químicos para garantizar la calidad y eficiencia de la separación. Ampliamente utilizado: la herramienta más común para la extracción de ADN. Alto rendimiento: las centrífugas de alta velocidad pueden manejar múltiples muestras, lo que las hace adecuadas para experimentos de alto rendimiento y procesamiento rápido. Contras: Requiere equipo especializado No puede manejar muestras grandes o cantidades de muestra	Puede separar eficazmente residuos celulares y contaminantes para garantizar la pureza y calidad del ADN. Una herramienta indispensable para la extracción de ADN y experimentos de biología molecular.
Precipitación de fenol/cloroformo	Ventajas: Altamente eficiente, capaz de eliminar proteínas y otras impurezas. Adecuado para la mayoría de los tipos de muestras, incluidas células, tejidos y mezclas de ácidos nucleicos. Contras: Utiliza disolventes orgánicos y plantea algunos riesgos de seguridad para el operador. Requiere múltiples pasos y un manejo cuidadoso.	Adecuado para la purificación de ADN y ARN de alta calidad, especialmente para el aislamiento preciso de ácidos nucleicos.
Precipitación de etanol	Ventajas: Sencillo, económico y relativamente seguro. Adecuado para una amplia gama de tipos de muestras. Contras: Menos selectivo y es posible que no elimine todas las impurezas. Por lo general, se necesita más tiempo para lograr la precipitación deseada.	Adecuado para la extracción general de ADN y ARN, especialmente para el procesamiento rápido de grandes cantidades de muestras.
Precipitación de isopropanol	Ventajas: Más simple y seguro que la precipitación con fenol/cloroformo. Adecuado para una amplia gama de tipos de muestras. Contras: Menos selectivo, puede que no elimine todas las impurezas. Paso de precipitación más largo.	Adecuado para extracción general de ADN y ARN y para laboratorios que requieren una manipulación más segura.

Cada método de sedimentación tiene sus características y debe elegirse según las necesidades específicas del experimento y el tipo de muestra. Las centrífugas son las más eficientes y proporcionan los mejores resultados de sedimentación, pero requieren la compra de una máquina y no permiten un procesamiento de gran volumen.

La precipitación con fenol/cloroformo es uno de los métodos más utilizados porque elimina eficazmente los contaminantes. Sin embargo, hay que manipularlo con cuidado porque el fenol y el cloroformo son tóxicos.

Los métodos de precipitación con etanol e isopropanol son relativamente más simples pero menos selectivos y pueden requerir más pasos de procesamiento para eliminar las impurezas. Por lo tanto, la elección del método de precipitación apropiado depende de los requisitos específicos del experimento y de las muestras que se procesan.

Lavado:

El lavado del ADN precipitado elimina contaminantes residuales como sales y proteínas. Esto se hace mediante centrifugación, en la que se recoge el sedimento de ADN y se desecha la solución de lavado.

Elución:

El ADN purificado se resuspende en una solución de elución, normalmente un tampón bajo en sal o agua desionizada. Este paso produce una solución de ADN altamente purificada para aplicaciones posteriores.

Soluciones para diferentes tipos de purificación de ADN

De acuerdo con las siguientes diferentes necesidades de purificación de muestras, combinadas con nuestra centrífuga o fotómetro de extracción de ADN y equipo de electroforesis, podemos ayudarlo a encontrar la solución más adecuada para sus necesidades de purificación de ADN.

Aislamiento de ADN de tejido sólido

En el aislamiento del ADN genómico de tejido sólido, es importante utilizar el tipo adecuado de centrífuga. Esto se debe a que asegura la separación efectiva del ADN y la eliminación de otros componentes del tejido. Al seleccionar una centrífuga, se deben considerar la fuerza centrífuga requerida, el tiempo de centrifugación y la capacidad de la muestra. Tanto las centrífugas de alta velocidad como las de espiral funcionan bien para el aislamiento del ADN después de la escisión con Proteinasa K.

1. Velocidad de centrifugación: Generalmente, usar una fuerza de centrifugación de 14 000 a 20 000 xg (gravedad) es un rango común. Para evitar una precipitación excesiva de ADN, se puede realizar una prueba previa para determinar la velocidad de centrifugación óptima.

2. Tiempo de centrifugación: normalmente entre unos pocos minutos y 30 minutos. Fuerzas de centrifugación más elevadas suelen requerir tiempos de centrifugación más cortos. En general, la centrifugación debe realizarse durante el tiempo suficiente para garantizar una extracción adecuada del ADN, pero también se debe evitar una centrifugación excesiva para evitar una precipitación excesiva del ADN.

Con un RCF máximo de 29200 xg, esta centrífuga puede realizar la mayoría de las extracciones de ADN en tejidos sólidos. Y con una gran capacidad de 750 ml x 4, puede completar rápidamente una variedad de experimentos de separación de alto volumen.

Si cree que la capacidad de esta centrífuga es demasiado grande, lo que genera desperdicio durante su uso, también tenemos instrumentos con un RCF máximo de 23797 (xg) y una capacidad de 100 ml × 4. Por supuesto, también disponemos de muchas otras centrífugas de alta velocidad. Si está interesado, puede dejar que nuestros ingenieros, según sus necesidades, le recomienden la solución más ideal.

Extracción de ADN de tejido vegetal.

La lisis de material vegetal es particularmente difícil porque lo es especialmente cuando se trata de tejidos duros o leñosos. Por lo tanto, el equipo adicional requerido incluye no sólo una centrífuga sino también un dispositivo capaz de romper las semillas.

Centrífugas Por lo general, necesitamos utilizar centrífugas de alta velocidad, especialmente para muestras grandes de células y tejidos vegetales. Los tejidos vegetales grandes pueden contener más paredes celulares y orgánulos, por lo que se necesitan fuerzas centrífugas más altas para separar el ADN. La centrífuga de alta velocidad CFG-15HM está diseñada para la purificación manual o automatizada de ADN de 96 pocillos a partir de tejido de hojas y semillas de plantas.

Los siguientes tipos de centrífugas son adecuados para la extracción de ADN vegetal:

Aislamiento de ADN de tejido de fruta.

La mayoría de los experimentos de aislamiento de ADN de frutas no suelen requerir una centrífuga. El ADN se extrae de muestras de frutas y no implica la separación de núcleos ni restos celulares. Generalmente, los experimentos de extracción de ADN de frutas se pueden realizar utilizando reactivos y utensilios domésticos sencillos. Esto los hace ideales para actividades educativas y científicas, especialmente en laboratorios escolares o entornos domésticos.

Por ejemplo, los pasos del experimento de extracción de ADN de fresa:

1. Corta las fresas en trozos pequeños y colócalas en una bolsa o vaso de plástico.

2. Agrega agua salada y detergente a las fresas y agita suavemente para mezclar.

3. Colar la mezcla a través de una malla plástica para eliminar los residuos y las partes sólidas.

4. Recoger el jugo de fresa pasado por el filtro y verterlo en un embudo de plástico.

5. Con cuidado vierte alcohol en el embudo para estratificarlo con el jugo de fresa.

6. Observe cómo el ADN precipita en la capa de alcohol, formando una sustancia blanca parecida a un hilo.

7. Extraiga con cuidado el material similar a un hilo de ADN utilizando un tubo de centrífuga de plástico o una botella pequeña.

Suero y Plasma - Extracción de ADN

Ofrecemos una amplia selección de centrífugas de alta eficiencia para obtener ADN libre purificado y de alta calidad a partir de muestras de plasma. No se requiere ningún tratamiento previo de la muestra. En aproximadamente 60 minutos, obtendrá altos rendimientos de ADN amplificable para ensayos posteriores, incluidos qPCR, NGS y PCR digital.

Por supuesto, en laboratorios clínicos o de investigación, la separación del plasma y el suero suele realizarse en una centrífuga refrigerada para mantener las muestras estables a bajas temperaturas. Las siguientes son recomendaciones para la CENTRÍFUGA REFRIGERADA:

Extracción de virus-ADN

Las células bacterianas suelen ser pequeñas y su aislamiento suele requerir centrífugas de alta velocidad. Se requieren fuerzas centrífugas más elevadas para separar eficazmente los desechos celulares y el ADN.

Tarjetas de gel - extracción de ADN

Las tarjetas de gel se utilizan comúnmente para tipificación sanguínea, detección de enfermedades y aislamiento y pruebas de ADN. En el caso del aislamiento de ADN, se suelen utilizar centrífugas para separar las muestras de las tarjetas de gel. El tipo de centrífuga adecuada para la extracción de ADN con tarjeta de gel depende de la tarjeta de gel utilizada para el experimento y de las condiciones de separación deseadas.

Una microcentrífuga es la opción más común, ya que es adecuada para microtubos y muestras pequeñas. Este tipo de centrífuga normalmente puede separar muestras de tarjetas de gel a altas velocidades para su posterior análisis. Las microcentrífugas suelen tener una variedad de opciones de rotores y tubos para diferentes tipos y tamaños de tarjetas de gel.

Considere una centrífuga o ultracentrífuga de mesa para muestras más grandes o separaciones con tarjetas de gel de gran volumen. Estas centrífugas tienen fuerzas y capacidades centrífugas más altas y son adecuadas para experimentos a gran escala.

Aislamiento de ADN de alimentos

Los materiales alimentarios plantean el mayor desafío para la lisis celular y la extracción de ADN. Se recomiendan centrífugas de velocidad ultraalta o alta, ya que tienen suficiente fuerza centrífuga y velocidad para separar el ADN en un tiempo relativamente corto y al mismo tiempo eliminar otros componentes como lípidos, proteínas y desechos.

Purificación de ADN plásmido

La purificación del ADN plasmídico consiste en extraer ADN plasmídico de microorganismos, como bacterias u hongos, eliminar impurezas y purificar el ADN plasmídico mediante una serie de pasos experimentales. Un plásmido es una molécula de ADN circular, que generalmente se encuentra en células microbianas, que puede transportar información genética importante. Por lo tanto, la purificación del ADN plasmídico es muy importante para la investigación y las aplicaciones de la biología molecular.

La primera consideración en la purificación de plásmidos es la separación del ADN plasmídico del ADN cromosómico y el ARN celular de la bacteria huésped.

Todos los sistemas de aislamiento de plásmidos de Scitek utilizan el método de desnaturalización alcalina SDS.

Las siguientes son consideraciones generales para la extracción de ADN plasmídico.

Crecimiento bacteriano y condiciones culturales.

El aislamiento exitoso de ADN plasmídico de alta calidad comienza con la preparación del cultivo. Muchos factores pueden afectar el crecimiento de las células bacterianas. Mantenga la biomasa dentro del rango aceptable para el sistema de aislamiento de plásmido utilizado, ya que la sobrecarga puede provocar una pureza y un rendimiento deficientes del ADN del plásmido. El tiempo de incubación del cultivo afecta el rendimiento y la calidad del ADN plasmídico aislado. Los cultivos bacterianos insuficientemente densos producen cantidades relativamente bajas de ADN. Los cultivos demasiado crecidos pueden dar como resultado rendimientos insatisfactorios y una contaminación excesiva del ADN cromosómico debido a la autolisis de las células bacterianas después de alcanzar una fase estable. No recomendamos incubar cultivos durante más de 18-20 horas.

Selección de antibióticos

La mayoría de los plásmidos portan genes marcadores de resistencia a antibióticos específicos. Sólo las células que contienen el plásmido objetivo proliferarán añadiendo el antibiótico seleccionado al medio de crecimiento. Agregar antibióticos a la concentración deseada ayudará a maximizar la producción de plásmidos.

Cómo probar la concentración y pureza del ADN

Detectar la concentración y pureza del ADN después de su extracción es un paso importante para garantizar la calidad de una muestra de ADN. Hay una variedad de métodos que puede utilizar para esta prueba y los siguientes son algunos de los más comunes:

Espectrofotómetro UV-Visible:

La espectrofotometría es uno de los métodos más utilizados para medir la concentración y pureza del ADN. Determina la concentración midiendo la absorbancia de la luz de una solución de ADN en una longitud de onda específica. Una longitud de onda típica es de 260 nanómetros (nm). La pureza generalmente se puede evaluar mediante la relación entre la longitud de onda de 260 nm y la longitud de onda de 280 nm (relación A260/A280). Una muestra de ADN de alta calidad suele tener una proporción A260/A280 entre 1,7 y 2,0.

Fluorometría

El método de fluorescencia utiliza ADN unido a un tinte fluorescente para medir la concentración de ADN. Este método suele ser más sensible que la espectrofotometría y puede utilizarse para concentraciones bajas de ADN. Se encuentran disponibles varios tintes de ADN y dispositivos de detección disponibles comercialmente para ayudar a realizar mediciones precisas de la concentración de ADN.

Electroforesis en gel de agarosa

La electroforesis en gel de agarosa es un método de análisis de ADN de rutina que puede utilizar para evaluar el tamaño y la pureza del ADN. Aunque no mide con precisión la concentración, puede usarse para detectar si el ADN está contaminado o degradado.

Métodos colorimétricos

Los métodos colorimétricos utilizan un reactivo de tinción que se une al ADN y produce un cambio de color específico que puede detectarse mediante espectrofotometría o fluorometría. El método colorimétrico proporciona una medición precisa de la concentración de ADN.

nanogota

El Nanodrop es un microespectrofotómetro diseñado para detectar concentraciones de ácidos nucleicos y proteínas. Puede medir muestras a nivel micro con alta sensibilidad.

Instrumentos comunes utilizados en experimentos de purificación de ADN

Los instrumentos y equipos que normalmente se utilizan en los experimentos de purificación de ADN dependen del proceso experimental y de las necesidades específicas. Los siguientes son algunos instrumentos y equipos comunes:

1. Centrífuga: Las centrífugas separan las partículas sólidas de los líquidos en una muestra. En la purificación del ADN, las centrífugas separan el ADN, las proteínas, los restos celulares y otros componentes. Las centrífugas de alta velocidad, las microcentrífugas y las centrífugas de refrigerador son tipos comunes.

2. Accesorios para centrífugas: Los accesorios para centrífugas, como rotores, tubos y soportes, se pueden personalizar para adaptarse al tipo y volumen de la muestra.

3. Termociclador: El termociclador se utiliza para técnicas de amplificación de ADN como la PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Puede realizar ciclos rápidamente a diferentes temperaturas para la replicación y amplificación del ADN.

4. Espectrofotómetro UV-Vis: este espectrofotómetro se utiliza para medir la concentración y pureza del ADN. Mide la absorbancia de una muestra de ADN para determinar la concentración y pureza del ADN.

5. Sistema de electroforesis: se utiliza una unidad de electroforesis para separar fragmentos de ADN y detectar el tamaño y la pureza del ADN. Incluye tanque de electroforesis, fuente de alimentación, gel y tampón de electroforesis.

6. Bomba de vacío y sistema de filtración: se utiliza para eliminar productos de desecho y solventes de una solución, generalmente en el paso de extracción en fase sólida de la purificación de ADN.

7. Instrumentación de PCR: la instrumentación de PCR se utiliza para realizar la amplificación de PCR y generalmente incluye un ciclador térmico y placas o tubos de PCR asociados.

8. Concentrador de vacío: Se utiliza para concentrar ADN u otras muestras de ácido nucleico para eliminar agua u otros disolventes.

9. Espectrómetro de masas: se puede utilizar un espectrómetro de masas para analizar la masa y la composición molecular de una muestra de ADN o ácido nucleico.

La elección del instrumento y equipo a utilizar depende del proceso específico de purificación de ADN y de los requisitos experimentales. Diferentes experimentos pueden requerir diferentes instrumentos para realizar diferentes pasos para garantizar que se obtenga una muestra de ADN de alta calidad.