¿Por qué la PCR siempre produce un montón de bandas inespecíficas?
Uno de los problemas más frustrantes en la PCR es cuando los resultados de la electroforesis muestran un montón de bandas aleatorias no específicas además de la banda objetivo. A veces, los dímeros del cebador son incluso más brillantes que la banda objetivo. Cuando esto suceda, no se apresure a culpar a los cebadores o a la plantilla. Primero, verifique si ha utilizado correctamente la función de detección de gradiente de su termociclador de gradiente.
Utilice un termociclador de gradiente para encontrar rápidamente la temperatura de recocido óptima
La causa más común de amplificación inespecífica es una temperatura de recocido demasiado baja. Esto permite que los cebadores se unan a sitios no específicos de la plantilla. En este caso, en lugar de rediseñar los cebadores, es mejor realizar primero una detección de gradiente de temperatura utilizando un ciclador térmico de gradiente. El método es simple: basándose en el valor de Tm del cebador, establezca un rango de temperatura con una fluctuación de 5 a 10 °C. Por ejemplo, si la Tm del cebador es 60 °C, establezca un gradiente de 55 °C a 65 °C. Realice 2 o 3 réplicas a cada temperatura, incluido un control negativo. Después de la electroforesis en gel, identifique la temperatura a la que la banda objetivo es más brillante y las bandas inespecíficas son mínimas: esa es su temperatura de recocido óptima.
Un "truco oculto" para reducir la amplificación inespecífica
Si todavía hay bandas inespecíficas después de la detección de gradiente, puede probar la función "Touchdown PCR" en su termociclador de gradiente. Esta función utiliza una temperatura de recocido más alta durante los primeros ciclos. Luego, la temperatura se reduce entre 0,5 y 1 °C por ciclo hasta alcanzar la temperatura de recocido final establecida. Esto permite que los cebadores se unan preferentemente al sitio objetivo perfectamente coincidente. Esto reduce significativamente la probabilidad de amplificación inespecífica. En muchos casos, las muestras que no logran producir bandas limpias con protocolos estándar pueden producir resultados excelentes utilizando un protocolo de PCR de aterrizaje.
¿Qué hacer cuando resulta difícil amplificar plantillas con alto GC?
Si su plantilla tiene un contenido de GC particularmente alto (más del 60%), puede agregar entre un 5% y un 10% de DMSO o glicerol a la mezcla de reacción mientras configura el gradiente de temperatura. Luego, utilice el termociclador de gradiente para detectar temperaturas de recocido más altas; Esto a menudo resuelve las dificultades de amplificación con plantillas con alto contenido de GC.
De hecho, la mayoría de los problemas de amplificación por PCR se pueden resolver mediante la optimización de las condiciones utilizando un ciclador térmico de gradiente.
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