La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite una rápida amplificación de fragmentos de ADN en las condiciones adecuadas, lo que da como resultado muchas secuencias de ADN diana, lo cual es esencial para la investigación biológica y los aspectos terapéuticos clínicos.
Cada componente de la reacción de la PCR afecta los resultados y el recocido es fundamental para la alta especificidad de la PCR. Para garantizar que pueda producir con éxito productos de amplificación reproducibles sin amplificación o contaminación no específica, debe mejorar las posibilidades de éxito de los experimentos de PCR mediante un diseño de cebador, condiciones de reacción y un entorno estéril adecuados.
Tipos de PCR
PCR convencional/de punto final
Este es el tipo de reacción de PCR más económico y se puede realizar directamente utilizando un ciclador térmico seguido de la detección de secuencia mediante electroforesis en gel. Cuando se prueba solo la presencia de secuencias de ADN en una muestra, la PCR convencional/de punto final puede dar una respuesta rápida en unos minutos.
PCR múltiplex
La PCR multiplex se caracteriza por el uso de múltiples cebadores, lo que permite a los investigadores obtener múltiples objetivos simultáneamente en la misma reacción de PCR. La PCR multiplex a menudo requiere una optimización exhaustiva de las condiciones de hibridación para lograr la máxima eficiencia de amplificación con diferentes sistemas de cebador-plantilla. Es una forma rentable de reducir la muestra requerida, aumentando así el rendimiento y ahorrando tiempo en comparación con los experimentos de PCR individuales.
Para el éxito de la PCR multiplex son esenciales procedimientos rigurosos de inicio en caliente y sistemas de almacenamiento intermedio especialmente optimizados. Por lo tanto, para realizar experimentos de PCR múltiple exitosos, el experimentador debe planificar el diseño del cebador y las condiciones de reacción antes del experimento para minimizar la reactividad cruzada del cebador y la unión no específica. Además, es necesario coordinar las temperaturas de desenrollado de diferentes cebadores para garantizar que puedan amplificar las secuencias objetivo simultáneamente.
PCR de largo alcance
La PCR de largo alcance puede amplificar secuencias de ADN más largas que la PCR convencional, normalmente desde 4 kb hasta decenas de kilobases. Se requiere una optimización frecuente durante la amplificación, especialmente para productos de PCR de más de 4 kb. Los cebadores deben ser lo suficientemente específicos y los valores de longitud y Tm deben ser suficientemente altos. También es deseable que los cebadores tengan suficiente especificidad, longitud y valor de Tm para garantizar una unión estable a la secuencia diana.
PCR unicelular
La PCR unicelular implica amplificar células individuales en PCR para obtener información sobre los tipos de células y los cambios dinámicos durante el desarrollo. La citometría de flujo o la manipulación microscópica pueden aislar células individuales de interés según los marcadores de la superficie celular o la apariencia física.
PCR de ciclo rápido
Como sugiere el nombre, la PCR de ciclo rápido permite que las reacciones de PCR se completen en un período más corto, lo que acorta el tiempo de preparación experimental y permite a los investigadores más tiempo para el análisis posterior. La PCR de ciclo rápido requiere condiciones de reacción optimizadas y reactivos altamente optimizados para garantizar la especificidad y sensibilidad de la amplificación. Es susceptible a la contaminación exógena del ADN, por lo que reaccionar en un ambiente estéril es esencial.
PCR específica de metilación (MSP)
MSP puede determinar el estado de metilación del ADN objetivo después del tratamiento con bisulfito. El método requiere el diseño de dos conjuntos de cebadores: uno para hibridar con citosina inalterada (es decir, metilado en ADN genómico) y otro para hibridar con uracilo producido como resultado del tratamiento con bisulfito de citosina no metilada en ADN genómico.
Debe utilizar condiciones de PCR estrictas y altamente específicas para evitar la unión de cebadores no específicos y la amplificación de artefactos de PCR. Esto es particularmente importante. Porque la conversión de citosina no metilada en uracilo reduce la complejidad del ADN y aumenta la probabilidad de unión no específica del cebador y la plantilla.
PCR de inicio en caliente
La aplicación de PCR de inicio en caliente debe bloquear la actividad de la polimerasa antes de comenzar, lo que puede reducir eficazmente la aparición de amplificación no específica. Es adecuado para detectar secuencias objetivo de baja abundancia, como genes mutantes raramente presentes o trazas de ADN patógeno.
PCR de alta fidelidad
La PCR de alta fidelidad es adecuada para amplificar plantillas de ADN más largas y el uso de polimerasas de alta fidelidad es fundamental para reducir eficazmente la tasa de error en la reacción.
RAPD: análisis rápido de ADN polimórfico amplificado
RAPD es una herramienta basada en PCR para estudiar organismos a nivel molecular. Utiliza cebadores pequeños y no específicos para amplificar regiones aparentemente aleatorias del ADN genómico. Cuando se analizan en geles de agarosa, los pares de cebadores exitosos producen diferentes perfiles de bandas de productos de PCR entre individuos, cepas, especies, etc. En RAPD, los cebadores se utilizan para amplificar el ADN del genoma.
En RAPD, los cebadores tienen sólo unas 10 bases de longitud. Por lo tanto, se requieren temperaturas de recocido de <40°C.
RAPE: Análisis rápido de ADN polimórfico amplificado
RACE es una variante de RT-PCR. Generalmente se utiliza para clonar el ADNc incompleto restante. Hay dos técnicas generales:
5' RACE - amplificación del final del ADNc 5'
3' RACE - amplificación de los extremos del ADNc 3'
El primer paso, el mismo para ambos tipos de RACE, implica convertir el ARN en ADNc monocatenario mediante transcriptasa inversa.
El segundo paso es único para cada tipo de RACE, aunque cada uno produce información que puede producir una secuencia de ADNc de longitud completa.
Debido a que RACE utiliza un 'sitio de anclaje' dentro del ARNm como punto de referencia, a veces se le llama 'PCR anclada'.
PCR in situ
In situ, la PCR puede identificar marcadores celulares y localizar aún más secuencias específicas de células dentro de una población celular. Es una herramienta poderosa en aplicaciones como estudios de progresión de enfermedades.
El procedimiento puede utilizar muestras de tejido o células frescas o fijadas, pero la preparación de la muestra es fundamental para los resultados, ya que la fijación afecta directamente a la señal de PCR. El procedimiento se adapta a sondas de ácido nucleico marcadas radiactivamente, marcadas con fluorescencia o marcadas con biotina.
PCR con pantalla diferencial
La PCR de visualización diferencial compara e identifica diferencias en los patrones de expresión de ARNm (y genes) entre dos líneas celulares o poblaciones.
La técnica se inventó en la década de 1990 y rápidamente se convirtió en una herramienta clave para el análisis de la expresión genética. Sin embargo, recientemente ha sido reemplazado por RNA-seq, microarrays y qRT-PCR.
PCR digital y de gotas digitales (dPCR/ddPCR)
Aunque es menos común, este tipo de reacción de PCR se usa a menudo en aplicaciones con muestras complejas o raras. La dPCR divide la muestra de ADN en varios compartimentos, cada uno de los cuales probablemente contenga una única secuencia. Este análisis estima la cantidad de material de partida en la muestra de ADN original.
PCR cuantitativa
La PCR cuantitativa (qPCR) también se conoce como PCR en tiempo real. Un termociclador en tiempo real registra la señal de fluorescencia durante cada ciclo de PCR en qPCR.
Diferencia entre qPCR y dPCR
La qPCR permite la cuantificación relativa del ADN objetivo y proporciona un método confiable y establecido para probar la presencia o ausencia de secuencias específicas.
La dPCR utiliza un método químico similar para detectar secuencias de ADN y se realiza en muchos volúmenes o gotas diminutas, utilizando el poder de las matemáticas para mejorar la relación señal-ruido. Aquí hay una breve comparación de los dos:
| Característica | PCR digital (dPCR) | PCR cuantitativa (qPCR) |
|---|
| Principio | Partición de la muestra en miles de pequeñas particiones; análisis de punto final | Amplificación continua de ADN con detección de fluorescencia en tiempo real |
| Amplificación | Cada partición contiene una o varias copias de ADN; la amplificación ocurre dentro de cada partición | Amplificación continua hasta que la señal de fluorescencia alcance un umbral detectable |
| Sensibilidad | Mayor sensibilidad debido a la cuantificación absoluta y la detección de eventos raros | Menor sensibilidad debido al potencial de sesgos de amplificación e inhibición. |
| Precisión | Mayor precisión ya que se logra una cuantificación absoluta para cada partición | Precisión moderada debido a la variabilidad en los ciclos de amplificación. |
| rango dinámico | Rango dinámico más amplio debido a la cuantificación absoluta en una amplia gama de concentraciones | Rango dinámico limitado debido a la amplificación exponencial |
| Precisión de cuantificación | Mayor precisión para la cuantificación absoluta y susceptibilidad reducida a los inhibidores de la PCR | Precisión ligeramente menor debido al potencial y la susceptibilidad reducida a los inhibidores de la PCR |
| Unidades de cuantificación | Copias/μL o copias por partición | Valores de umbral de ciclo (Ct) |
| Solicitud | Ideal para detección de mutaciones raras, cuantificación absoluta y recuento digital | Ampliamente utilizado para análisis de expresión genética, genotipado de SNP y detección de patógenos. |
| Multiplexación | Capacidades de multiplexación limitadas | Mayores capacidades de multiplexación con sondas fluorescentes |
| Costo | Costo generalmente más alto debido a equipos y reactivos especializados. | Costo generalmente más bajo debido a la amplia disponibilidad de equipos y reactivos. |
Enzimas utilizadas en PCR
Hay varias enzimas clave que desempeñan un papel importante en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las siguientes son las enzimas que se utilizan principalmente en el proceso de PCR:
ADN polimerasa Taq
La ADN polimerasa Taq es la enzima más clásica y comúnmente utilizada en reacciones de PCR. Puede estabilizar su actividad a altas temperaturas y es adecuado para muchos ensayos de PCR. Es necesario configurar la reacción en hielo para evitar una amplificación no específica durante la reacción.
ADN polimerasas utilizadas en PCR
| Propiedades enzimáticas | ADN polimerasa
familia A | ADN polimerasa
familia B
|
|---|
| Enzimas disponibles | Taq ADN polimerasa | Enzimas correctoras
|
| Actividad exonucleasa 5'-3' | + | – |
| Actividad exonucleasa 3'-5' | – | + |
Tarifa de extensión
(nucleótidos/segundo) | ~150 | ~25
|
| Tasa de error (por pb/por ciclo) | 1 en 103/104 | 1 en 105/106
|
| Aplicaciones de la PCR | Estándar, inicio en caliente, transcripción inversa, en tiempo real | Alta fidelidad, clonación, mutagénesis dirigida al sitio |
| A-adición | + | A veces |
ADN polimerasa de inicio en caliente
Cuando la reacción de amplificación se establece a temperatura ambiente, los cebadores pueden unirse de forma no específica entre sí para formar dímeros de cebador. Durante el ciclo de amplificación, los dímeros del cebador pueden extenderse para producir productos no específicos, lo que reduce el rendimiento de productos específicos.
La PCR de inicio en caliente es fundamental para obtener resultados específicos exitosos en aplicaciones de PCR más desafiantes. Para generar ADN polimerasa de arranque en caliente, los anticuerpos pueden inhibir la actividad de la ADN polimerasa Taq a temperaturas más bajas.
Por el contrario, durante el arranque en caliente mediado por anticuerpos, el anticuerpo se une a la polimerasa a través de fuerzas no covalentes relativamente débiles, lo que deja algunas moléculas de polimerasa en un estado activo. Esto a veces conduce a una mayor amplificación de productos de extensión de cebadores no específicos durante la PCR. Cuando se procesan en geles de agarosa, estos productos aparecen como fragmentos manchados o de tamaño incorrecto.
ADN polimerasa de alta fidelidad
Las enzimas de PCR de alta fidelidad normalmente proporcionan actividad exonucleasa de ácido nucleico de 3' a 5' para eliminar bases mal incorporadas. Las enzimas PCR de alta fidelidad son adecuadas para aplicaciones que requieren bajas tasas de error, como clonación, secuenciación y mutagénesis dirigida. Sin embargo, si la enzima no se proporciona en la versión de inicio en caliente, la actividad exonucleasa del ácido nucleico de 3' a 5' puede degradar los cebadores durante la configuración de la PCR y las primeras etapas de la PCR. La activación no específica causada por cebadores acortados puede provocar un arrastre en el gel o un fallo de amplificación, especialmente si se utiliza una pequeña cantidad de plantilla.
La función de corrección a menudo hace que la enzima de alta fidelidad funcione más lentamente que otras ADN polimerasas. Además, la función de adición A requerida para la clonación directa de UA o TA se reduce considerablemente, lo que resulta en la necesidad de ligar y transformar clones de extremos planos menos eficientes.
Transcriptasa inversa
Se utiliza en la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) para transcribir el ARN en el ADN correspondiente. Las transcriptasas inversas de uso común incluyen la transcriptasa inversa M-MLV y la transcriptasa inversa AMV.
ADN polimerasa termolábil
Se utilizan en la etapa final de la reacción de PCR para eliminar una posible contaminación residual del ADN. Estas enzimas están inactivas durante el paso de PCR de rutina pero están activas durante el paso de amplificación final.
Diseño de cebadores de PCR
La secuencia óptima del cebador y la concentración adecuada del cebador son fundamentales para lograr la máxima especificidad y eficiencia de la PCR.
Secuencia de imprimación:
Evite la parsimonia de 3 nucleótidos en el extremo 3', es decir, utilice tripletes codificantes de Met o Trp en el 3'.
Para mejorar la eficacia de unión cebador-plantilla, reduzca la concatenación permitiendo algunos desajustes entre el cebador y la plantilla, especialmente en el extremo 5', pero no en el extremo 3'.
Diseñe cebadores con menos de 4 veces de parsimonia en cualquier posición determinada.
Concentración de imprimación:
Comience la PCR con una concentración de cebador de 0,2 m.
Si la eficiencia de la PCR es deficiente, aumente la concentración del cebador en incrementos de 0,25 m hasta obtener resultados satisfactorios.
Directrices para el diseño y uso de imprimaciones.
| PCR estándar | PCR múltiplex | RT-PCR de un solo paso
|
|---|
| Longitud | 18 a 30 veces | 21–30 nt | 18 a 30 veces
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| contenido de GC | 40-60% | 40–60% | 40-60%
|
| información | La Tm de todos los pares de cebadores debe ser similar. | La Tm de todos los pares de cebadores debería ser similar. Para obtener resultados óptimos, la Tm debe ser de 60 a 88 °C. | La Tm de toda imprimación.
los pares deben ser similares.
El Tm no debe ser
inferior a la temperatura de la transcripción inversa (p. ej., 50 °C)
|
| Estimación de la temperatura de recocido óptima | 5°C por debajo de la Tm calculada | 5 a 8 °C por debajo de la Tm calculada (cuando es superior a 68 °C) o 3 a 6 °C por debajo de la Tm calculada (cuando es de 60 a 67 °C) | 5°C por debajo de la Tm calculada |
| Ubicación | – | – | Para evitar la detección de ADNg:
El cebador se hibrida con el extremo 3' de un exón y el extremo 5' del adyacente. exón. Alternativamente, el cebador se hibrida con una región flanqueante que contiene al menos un intrón.
Si sólo se conoce la secuencia del ARNm, elija sitios de hibridación de cebadores que sean
300 a 400 pb de diferencia. |
| Concentración, equivalencia de unidad A260 | 20–30 µg | 20–30 µg | 20–30 µg |
Guía de solución de problemas de PCR
Experimentos de PCR. Si encuentra resultados prácticos que no siempre cumplen con las expectativas, ¿sabe cuál es el motivo? A continuación, discutiremos los problemas que pueden ocurrir en el uso de PCR y técnicas de resolución de problemas:
| Causas | Soluciones |
|---|
Plantilla de ADN
| Pobre integridad | 1. Al aislar el ADN, minimice los cortes o incisiones en el ADN. 2. La integridad del ADN molde puede comprobarse mediante electroforesis en gel. 3. Almacene el ADN en agua de grado molecular o tampón TE (pH 8,0) para evitar la degradación por la nucleasa.
|
Baja pureza
| 1. Si se utiliza un protocolo de purificación de ADN químico o enzimático, asegúrese de que no queden inhibidores de la PCR. 2. Vuelva a purificar o precipitar y lavar el ADN con etanol al 70 % para eliminar las sales o iones residuales que puedan inhibir la ADN polimerasa.
|
| Desequilibrio de concentración | Prepare una mezcla de desoxinucleótidos nueva |
Subutilización
| 1. Aumente el volumen inicial de forma adecuada. 2. Seleccione ADN polimerasa con alta sensibilidad para la amplificación. 3. Incrementar adecuadamente el número de ciclos de PCR.
|
| Alto contenido de GC o estructura secundaria. | 1. Seleccionar ADN polimerasa con alta capacidad sintética. 2. Utilice aditivos o cosolventes de PCR para promover la desnaturalización del ADN rico en GC y secuencias con estructuras secundarias. 3. Aumente el tiempo o la temperatura de desnaturalización para disociar las plantillas de ADN bicatenario de manera eficiente.
|
| fragmento largo | 1. Confirme la capacidad de amplificación de fragmentos largos de la ADN polimerasa seleccionada. 2. Utilice una ADN polimerasa diseñada para PCR de fragmentos largos. 3. Seleccionar una ADN polimerasa con alta capacidad sintética. 4. Reduzca las temperaturas de recocido y extensión para promover la unión del cebador y mejorar la estabilidad térmica de la enzima. 5. Aumente el tiempo de extensión según la longitud del amplicón.
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| El ADN modelo está dañado | Repare la plantilla de ADN para limitar la exposición a los rayos UV al analizar o extraer productos de PCR del gel. |
| La secuencia requerida puede ser tóxica para el huésped. | La clonación en vectores sin expresión utiliza vectores de clonación con un número de copias bajo. |
| Cebador | Diseño problemático
| 1. Modifique el diseño del cebador. 2. Utilice una herramienta de diseño de imprimaciones en línea. 3. Asegúrese de que los cebadores sean específicos para el fragmento objetivo. 4. Confirme que el cebador complemente la cadena de ADN objetivo correcta.
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| Obsolescencia de la imprimación | 1. Resuspenda y dispense los cebadores y guárdelos adecuadamente. 2. Dispense imprimadores nuevos o compre imprimadores nuevos según sea necesario.
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| Dosis insuficiente | 1. Optimice la concentración del cebador (normalmente en el rango de 0,1 a 1 μM). 2. Para PCR de fragmentos largos y PCR con cebadores concatenados, la concentración inicial mínima es 0,5 μM.
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| ADN polimerasa inapropiada | 1. El uso de ADN polimerasa de arranque en caliente previene la degradación del cebador debido a la actividad exonucleasa del ácido nucleico 3'→5' de la ADN polimerasa corregida. 2. Prepare el sistema de reacción de PCR en hielo o agregue la ADN polimerasa a la mezcla de reacción.
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| Cantidad insuficiente de ADN polimerasa | 1. Seleccione una ADN polimerasa con alta sensibilidad para la amplificación.
2. Verifique la cantidad recomendada de ADN polimerasa para PCR y optimícela según sea necesario.
3. Aumentar la cantidad de ADN polimerasa utilizada. |
| Mg insuficiente2+ concentración | Optimizar el MG2+ concentración para obtener el mayor rendimiento de PCR. |
| Exceso de aditivos o cosolventes de PCR | 1. Utilice la concentración recomendada de cosolvente. 2. Utilice la concentración más baja posible. 3. Ajuste la temperatura de recocido. 4. Aumente la cantidad de ADN polimerasa o utilice una ADN polimerasa con alta capacidad de síntesis. 5. Considere la posibilidad de utilizar aditivos o cosolventes especiales para la ADN polimerasa específica.
|
| Reactivos desiguales | Mezcle bien para eliminar los gradientes de densidad que puedan desarrollarse durante la conservación y preparación de la reacción. |
| Condiciones de ciclo térmico | Resultados de desnaturalización insatisfactorios. | 1. Optimice el tiempo y la temperatura de desnaturalización del ADN.
2. Es posible que los tiempos de desnaturalización cortos y las bajas temperaturas no den como resultado una buena disociación del molde de ADN bicatenario. Por el contrario, los tiempos de desnaturalización prolongados y las altas temperaturas pueden disminuir la actividad enzimática. |
Resultados de recocido insatisfactorios
| 1. Utilice un ciclador de gradiente siempre que sea posible para optimizar progresivamente la temperatura de recocido en incrementos de 1 a 2 °C.
2. La temperatura de recocido óptima suele ser entre 3 y 5 °C inferior a la Tm más baja del cebador.
3. La temperatura de recocido debe ajustarse cuando se utilizan aditivos o codisolventes de PCR. Las temperaturas de recocido para los pares de cebadores varían según la ADN polimerasa. |
| Extensión insatisfactoria | 1. Seleccione un tiempo de extensión apropiado para la duración de la amplificación.
2. reducir la temperatura de extensión (p. ej., a 68 °C) mantiene la actividad enzimática cuando se amplifican fragmentos largos (p. ej., >10 kb).
3. Utilice una ADN polimerasa con alta capacidad de síntesis para lograr una amplificación estable incluso en tiempos de extensión cortos. |
| Número inadecuado de ciclos de PCR. | 1. ajuste el número de ciclos (generalmente 23-35 ciclos)
2. Aumente el número de ciclos a 40 si la cantidad inicial de ADN es inferior a 10 copias. |
| Desnaturalización insuficiente | El tiempo o la temperatura de desnaturalización se pueden aumentar para permitir una disociación eficaz del ADN. |
| Temperatura de recocido incorrecta | Seleccione la temperatura de recocido adecuada según las diferentes ADN polimerasas. |
| Temperatura de recocido demasiado baja | 1. Aumente la temperatura de recocido para mejorar la especificidad.
2. La temperatura de recocido óptima suele ser entre 3 y 5 °C inferior a la Tm más baja del cebador.
3. Utilice un ciclador de gradiente para optimizar la temperatura de recocido en incrementos de 1 a 2 °C.
4. Considere utilizar la PCR de aterrizaje para mejorar la especificidad. |
| Tiempo de recocido demasiado largo | Acorte el tiempo de hibridación para minimizar la unión del cebador a secuencias no específicas. |
| Temperatura de extensión demasiado alta | Reducir la temperatura de extensión en 3-4°C mejora la estabilidad térmica de la ADN polimerasa, especialmente para la PCR de fragmentos largos. |
| Tiempo de extensión insuficiente | 1. Al amplificar fragmentos de ADN más largos, aumente el tiempo de extensión. |
| demasiados ciclos | 1. Reducir el número de ciclos sin reducir significativamente el rendimiento del producto de PCR objetivo y evitar la acumulación de amplicones no específicos. |
| Errores de secuencia en productos de PCR. | Problemas con el diseño de la imprimación. | Evite repeticiones directas en secuencias de cebadores. |
| Baja calidad del producto | 1. Compre cebadores de PCR que hayan sido purificados para eliminar los oligonucleótidos de ADN que no son de longitud completa y que están truncados en el extremo 5'. |
| Contaminación por nucleasas | 1. utilizar reactivos libres de nucleasas de grado molecular para formular el sistema de reacción de PCR.
2. Formule el sistema de reacción en hielo para mantener las posibles exonucleasas de ácidos nucleicos contaminantes lo más bajas posible. |
| Daño ultravioleta al ADN | 1. Utilice una caja de luz UV de onda larga (360 nm) para observar los fragmentos en el gel, manteniendo el tiempo de exposición lo más corto posible.
2. Si utiliza una caja de luz de onda corta (254-312 nm), reduzca el tiempo de exposición a los rayos UV a unos segundos y coloque el gel en una placa de vidrio o plástico. |
| Errores de secuenciación | 1. Secuenciar la doble cadena de ADN para verificar la confiabilidad de los resultados de la secuenciación.
2. En la medida de lo posible, las muestras se tomarán por duplicado. |
| Amplificación falso positivo | Contaminación cruzada | 1. Utilice puntas de pipeta con barrera contra aerosoles.
2. Designe un área de trabajo separada y descontamine el área después de cada uso.
3. Utilice técnicas para prevenir la contaminación residual de la PCR, como el dopaje con dUTP y el tratamiento con UDG. |
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