¿Es lo mismo un termociclador que una máquina de PCR?

A menudo se piensa que un termociclador y una máquina de PCR son lo mismo, ya que ambos son esenciales para realizar experimentos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Sin embargo, si bien comparten funciones similares en el control de la temperatura durante la amplificación del ADN, diferencias sutiles en la terminología y la aplicación pueden tener un impacto significativo en el tipo de experimentos que se realizan. Este artículo explora las similitudes y distinciones entre un ciclador térmico y una máquina de PCR, ayudando a aclarar sus funciones en la biología molecular.

¿Qué es un termociclador de PCR?

Un ciclador térmico es un dispositivo que se utiliza para amplificar secuencias de ADN o ARN objetivo controlando los cambios de temperatura durante las reacciones de PCR. Puede subir y bajar temperaturas de forma rápida y precisa, respaldando los tres pasos básicos de la amplificación del ADN: desnaturalización, hibridación y extensión. Los termocicladores son equipos centrales para experimentos de PCR y qPCR; sin ellos, no se puede realizar la amplificación del ADN.

¿Qué es un instrumento de PCR?

Un instrumento de PCR es un dispositivo utilizado para la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de rutina y es un tipo de ciclador térmico. Controla la temperatura de reacción para facilitar el proceso de amplificación por PCR. Los instrumentos de PCR se utilizan principalmente para la amplificación por PCR estándar y son adecuados para la detección cualitativa (p. ej., determinar si un gen diana está presente). Los instrumentos de PCR generalmente carecen de la capacidad de monitorear la amplificación del ADN en tiempo real, por lo que se requiere un análisis posterior a la amplificación (p. ej., electroforesis en gel) para interpretar los resultados.

¿Diferencia entre los termocicladores qPCR y PCR?

qPCR significa PCR en tiempo real (PCR cuantitativa), que combina termocicladores con tecnología de detección de fluorescencia para monitorear la cantidad de productos amplificados durante cada ciclo de PCR. qPCR no solo realiza la amplificación del ADN, sino que también permite el análisis cuantitativo mediante el monitoreo en tiempo real de señales de fluorescencia, lo que permite la medición cuantitativa de la expresión genética, la carga viral y más. Por lo tanto, los sistemas de PCR en tiempo real pueden realizar análisis de muestras tanto cualitativos como cuantitativos, mientras que los sistemas de PCR estándar solo proporcionan análisis cualitativos de muestras.

Antes de cargar muestras en el termociclador, la reacción de PCR debe incluir varios reactivos (o premezclas) para garantizar una amplificación exitosa de la secuencia objetivo. Para las reacciones de PCR estándar, la muestra debe contener el ácido nucleico objetivo, agua libre de nucleasas (grado PCR), dNTP (trifosfatos de desoxirribonucleótidos), ADN polimerasa y oligonucleótidos personalizados diseñados para unirse a las regiones ascendentes y descendentes de la secuencia del gen objetivo. Para reacciones de PCR en tiempo real, la muestra debe contener cada uno de los reactivos anteriores, así como una sonda fluorescente o una molécula indicadora diseñada para aparearse con la secuencia objetivo.

Procedimiento de PCR estándar

El protocolo de PCR estándar incluye pasos iniciales y una secuencia de temperatura precisa de dos pasos, repetida durante 40 ciclos.

Paso 1: Desnaturalización: caliente la muestra a 95 °C durante 3 minutos para separar (o desnaturalizar) el ADN objetivo de doble cadena en cadenas simples.

Paso 2: Recocido: enfríe la muestra a 60 °C, la temperatura ideal para que los cebadores y la ADN polimerasa se unan (o se hibriden) con la secuencia objetivo.

Paso 3: Extensión: esto implica calentar la muestra a 72 °C para permitir que la ADN polimerasa use dNTP (o trifosfatos de desoxirribonucleótidos) para formar nuevas cadenas de ADN complementarias. Los pasos de hibridación y extensión se repiten 39 veces para producir millones de copias de la secuencia de ADN objetivo.

Procedimiento de PCR en tiempo real

El protocolo experimental de PCR en tiempo real es similar al protocolo experimental de PCR estándar, pero con una diferencia: el paso de hibridación también implica la unión de la sonda fluorescente (o molécula indicadora) a la cadena de ADN objetivo. Durante el paso de extensión, cuando la ADN polimerasa forma una nueva cadena complementaria, la sonda emite luz en una longitud de onda específica. En un protocolo experimental de 40 ciclos, el detector mide la luz producida durante la reacción, lo que permite a los investigadores analizar la tasa de amplificación de cada muestra según sea necesario. Debido a las diferencias en los protocolos experimentales, los tiempos de reacción de la PCR pueden variar, pero el tiempo de ejecución típico para una reacción de PCR estándar es de 90 a 100 minutos.

Conclusión

En conclusión, si bien un termociclador y una máquina de PCR cumplen la función crucial de controlar la temperatura para la amplificación del ADN, el término 'máquina de PCR' generalmente se refiere a una aplicación específica de un termociclador en experimentos de PCR. Básicamente, una máquina de PCR es un tipo de termociclador, pero no todos los termocicladores están diseñados exclusivamente para PCR. Comprender estos matices le ayudará a asegurarse de que está utilizando el equipo adecuado para sus necesidades de investigación específicas.