¿Qué es la HPLC?

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y la cromatografía de gases (GC) ocupan una posición importante en el análisis cromatográfico y son los métodos analíticos más utilizados en nuestra práctica de análisis de fármacos. Son de gran importancia para la determinación del contenido de drogas y el examen de sustancias relacionadas. Hoy continuaremos aprendiendo más sobre HPLC y esperamos que le resulte útil.

¿Qué es la cromatografía líquida de alta resolución?

HPLC es una técnica analítica que separa, identifica o cuantifica cada componente de la mezcla. En términos simples, HPLC es un método cromatográfico para separar y determinar muestras.

Un sistema HPLC generalmente consta de una bomba de infusión, un inyector, una columna, un detector, una unidad de procesamiento y registro de datos. La bomba de infusión, la columna y el detector son los componentes clave.

Términos comunes utilizados en el sistema HPLC

1. Resolución: relación entre la diferencia entre el tiempo de retención de dos picos vecinos y el ancho promedio del pico. También llamada resolución, indica el grado de separación de dos picos adyacentes.

2. Factor de cola: parámetro que evalúa la forma del pico calculando la relación entre el ancho del pico al 5% de la altura del pico y la distancia desde el ápice del pico hasta el borde de ataque. El propósito es garantizar el efecto de separación cromatográfica y la precisión de la medición, comúnmente utilizado como T para indicar.

3. Señal a ruido: la relación entre señal y ruido en cromatografía líquida. Es un índice importante para medir el rendimiento del cromatógrafo líquido y se utiliza para evaluar la resolución y sensibilidad del instrumento en la separación y detección de muestras.

4. Área/Altura se refiere al tamaño del área o la altura de los picos en cromatografía líquida, que puede reflejar el contenido y la concentración relativa de los componentes en la muestra, comúnmente utilizado en análisis cuantitativos.

5. Placas: También conocidas como eficiencia de la columna, uno de los parámetros de la columna de cromatografía. Empleado para articular numéricamente la eficacia de separación de la columna cromatográfica.

6. Tiempo de retención: el intervalo desde el inicio de la inyección de la muestra hasta el vértice cromatográfico de un componente se denomina tiempo de retención del componente. Es decir, desde la inyección hasta el intervalo de tiempo posterior a la columna en el que la concentración de un componente parece ser grande. Comúnmente utilizado en identificación cualitativa.

7. t: El tiempo de retención de un componente con un coeficiente de partición de 0 se denomina tiempo muerto. El aire o el metano suelen considerarse componentes y se utilizan para determinar el tiempo muerto.

¿Cómo funciona la HPLC?

Resumen simple: fase móvil → bomba → inyector → columna → detector → tambor de residuos

Algunos de ustedes no están seguros de la dirección de la conexión de la columna en diferentes sistemas HPLC (el orden de los módulos en el instrumento no siempre es fijo).

Por lo general, todo el proceso de flujo es fijo: en primer lugar, la bomba de infusión de alta presión extrae la fase móvil del vial de fase móvil y ingresa al sistema de inyección. En este sistema, la muestra se agrega a la ruta del flujo cambiando una válvula de seis vías. En este punto, la columna separa y analiza la muestra y el sistema de detección posterior se transmite en tiempo real al software para el perfilado de datos.

Sistema de infusión

La bomba de infusión es una de las partes más importantes del sistema HPLC y se compone principalmente de un dispositivo de almacenamiento de líquido, un filtro, un dispositivo de desgasificación y una bomba de infusión de alta presión.

1. Dispositivo de almacenamiento de líquidos: el disolvente debe seleccionarse de grado cromatográfico;

2. Filtro: la fase móvil debe filtrarse previamente con una membrana de 0,45 um antes de ingresar al sistema para evitar obstruir la columna, especialmente la sal tampón preparada con sal inorgánica;

3. Dispositivo desgasificador: La fase móvil se desgasifica mediante calentamiento, succión o absorción de helio para eliminar las burbujas de aire. Evita que las burbujas liberadas cuando la fase móvil sale de la columna de alta presión entren en el detector y provoquen un fuerte aumento del ruido, lo que afecta a la detección;

4. Bomba de infusión de alta presión: Su rendimiento incide directamente en la fiabilidad de los resultados del análisis. Intente elegir la bomba de infusión con presión suave y pulso pequeño.

   * Las bombas de infusión se clasifican según su modo de funcionamiento en bombas neumáticas y bombas mecánicas. En el proceso de análisis diario, a menudo utilizamos la bomba neumática en la bomba binaria y en la bomba cuádruple. Las bombas binarias tienen una mayor precisión de mezcla y una relación más precisa de mezcla de fase móvil. Las bombas cuaternarias son más económicas.

Sistema de muestreo

Dechado: Actualmente, la válvula de inyección de seis vías y el muestreador automático se utilizan más comúnmente en los sistemas HPLC. Tiene buen sellado y pequeño volumen.

La válvula de inyección de seis vías se divide en la vía principal y la vía de derivación, que generalmente deben cambiarse a la vía de derivación mediante el muestreo cuantitativo del anillo cuantitativo y luego volver a la vía principal mediante la fase móvil para promover las muestras obtenidas en la vía de derivación hacia la vía principal. sistema, para completar el muestreo.

Correspondiente a la figura de la izquierda está el estado listo del bypass en el sistema hplc; Correspondiente a la figura de la derecha es el estado de inyección.

1. La fase móvil y la columna forman un circuito cerrado; la muestra se inyecta desde la entrada y entra en el circuito cuantitativo, y el exceso se descarga en el cubo de líquido residual.

2. Después de que la muestra entre por completo, cambie la conexión de la válvula de seis vías. Actualmente, la fase móvil está conectada al anillo cuantitativo y la fase móvil empuja la muestra hacia la columna.

3. En este momento, la válvula de seis vías vuelve a cambiar el modo de conexión y vuelve al estado inicial, y la muestra a analizar se separa y se detecta mediante elución de la fase móvil.

Diagrama esquemático del principio de construcción de la válvula de entrada de seis vías.

Sistema de separación

El sistema de separación incluye la columna, la fase estacionaria y la fase móvil.

Estructura de la columna cromatográfica

Columna cromatográfica: Es la parte central del sistema de separación y consta de tubo de columna, tapa de presión, férula (anillo de sellado), placa de tamiz (filtro), juntas, tornillos, etc. Tiene los siguientes tipos principales:

Tipo	Característica
Columnas cromatográficas de fase inversa	Portador unido a un grupo no polar, cargas de uso común: gel de sílice unido a octadecilsilano (columna C18), gel de sílice unido a octilsilano (columna C8) y gel de sílice unido a fenilo, etc.
Columnas de fase normal	Columnas llenas de relleno de gel de sílice o gel de sílice unido a grupos polares.
Columnas de intercambio iónico	Columnas empaquetadas con cargas de intercambio iónico, divididas en columnas de intercambio catiónico y columnas de intercambio aniónico.
Columnas de separación quirales	Columnas llenas de rellenos quirales.

Parámetros que afectan el rendimiento de separación de la columna:

1. Parámetros propios: Longitud del diámetro interior de la columna, propiedades del relleno, tamaño de partícula y distribución granulométrica, tamaño de poro, superficie, etc.

2. Temperatura de la columna: la temperatura de la columna no debe exceder los 60 ℃. El aumento de la temperatura de la columna afectará el pico de impurezas; En teoría, cuanto mayor sea la temperatura de la columna, más rápido será el pico de cada sustancia, lo que favorece la mejora de la eficiencia de la columna y el aumento del grado de separación.

3. pH: columna de gel de sílice abierta con hidroxilo de sílice residual, el pH de la fase móvil generalmente debe estar entre 2 y 8; El hidroxilo de sílice residual se ha cerrado en gel de sílice, gel de sílice compuesto de polímero o columna de polímero, el ph de la fase móvil es generalmente superior a 8 o inferior a 2.

Fases móviles:Los sistemas de metanol-agua y acetonitrilo-agua se utilizan comúnmente para la cromatografía de fase reversa. Para la detección al final de la longitud de onda UV se prefieren los sistemas de acetonitrilo-agua. Siempre que sea posible, no se deben utilizar sales tampón en la fase móvil, y cuando se utilicen, se deberán utilizar en bajas concentraciones.

Sistema de detección

1. detector ultravioleta: Uno de los detectores más utilizados en sistemas HPLC y responde a la mayoría de los compuestos orgánicos.

   Características: Alta sensibilidad; amplio rango lineal; insensible a los cambios en el caudal y la temperatura de la fase móvil; longitud de onda seleccionable, fácil de operar;

   Limitaciones: Los disolventes con cierta absorción de UV no se pueden utilizar como fase móvil y la longitud de onda operativa del detector de absorción no puede ser menor que la longitud de onda de corte del disolvente.

   Específicamente, se puede dividir en detectores VWD y DAD.

2. Detectores de matriz de fotodiodos

3. Detector refractivo diferencial:

   Un detector universal basado en la concentración en el sistema HPLC que responde a todos los solutos;

   Características: baja sensibilidad, sensible a la temperatura, no se puede utilizar para elución en gradiente;

4. Detector de fluorescencia: El detector más sensible y altamente selectivo, la concentración mínima de detección puede alcanzar 0,1 ng/ml, adecuado para análisis de trazas, pero el rango lineal no es tan amplio como el del detector UV y puede detectar compuestos que pueden producir fluorescencia.

Comparación de HPLC y GC

Objeto de análisis

GC: Aplicable a muestras que pueden ser gasificadas, con buena estabilidad térmica y bajo punto de ebullición, representando el 20% de la materia orgánica.

HPLC: Aplicable a las muestras que se pueden disolver después de la disolución. Se pueden detectar muestras con alto peso molecular, dificultad de gasificación, mala estabilidad térmica y alto punto de ebullición.

Fase móvil

GC: La fase móvil es inerte, sin interacción entre los componentes y la fase móvil; la fase móvil solo transporta la muestra a través de la fase estacionaria y los componentes solo interactúan con la fase estacionaria.

HPLC: La fase móvil es líquida, y la fase móvil y los componentes de la interacción entre la participación y la influencia de la separación cromatográfica para la optimización de las condiciones cromatográficas y la mejora de la separación proporcionan una nueva idea.

Condiciones de funcionamiento

GC: operación de calefacción

HPLC: temperatura ambiente (la temperatura de la columna generalmente no supera los 60 ℃), alta presión

Sensibilidad

La sensibilidad de la detección en fase gaseosa es mayor que la de la fase líquida.

Rango de aplicación

El rango de aplicación de la fase líquida es mucho mayor que el de la fase líquida.

Comparación de HPLC de fase normal y HPLC de fase reversa

Las dos variantes más comunes de HPLC son la HPLC de fase normal y la HPLC de fase reversa.

HPLC en fase normal

Las columnas de HPLC están repletas de diminutas partículas de sílice y disolventes polares como el hexano.

Las columnas típicas tienen un diámetro interior de 4,6 mm o menos y una longitud de 150 a 250 mm.

Los compuestos no polares de la mezcla pasarán a través de la columna más rápidamente.

Cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa

La columna de HPLC es del mismo tamaño. La columna está llena de partículas de sílice modificadas para hacerlas no polares.

Usando un solvente polar, como una mezcla de agua y un alcohol, como metanol. Los compuestos polares de la mezcla pasarán a través de la columna más rápido debido a la fuerte atracción entre el disolvente polar y las moléculas polares.

La HPLC de fase reversa es la forma más comúnmente utilizada de HPLC.

Nota sobre el uso de columnas de cromatografía líquida de alto rendimiento

1. Haga coincidir el tipo de cabezal de columna de líquido de alto rendimiento y las juntas capilares de acero inoxidable: si las juntas y la profundidad del cabezal de columna no coinciden, habrá fugas de líquido o el volumen muerto será demasiado grande.

2. Coincidencia al cambiar entre diferentes disolventes

   Si el disolvente almacenado en la columna y el disolvente almacenado en el sistema del instrumento no coinciden con la fase móvil, se deben cambiar antes de su uso.

   Especialmente cuando la fase móvil contiene sales tampón, como la conservación del disolvente es una fase orgánica pura o una alta proporción de fase orgánica, si se conecta directamente a la columna cromatográfica, conducirá a la precipitación de cristales de sales tampón en la columna, y incluso conducir a una nueva columna de daños permanentes e irreversibles.

3. Equilibrio y envejecimiento de columnas nuevas antes de su uso.

4. rango de pH

   Generalmente, el rango de pH de las columnas cromatográficas es de 2 a 8.

5. Almacenamiento de columnas de HPLC

   La fase móvil utilizada para un almacenamiento a corto plazo de 1 a 2 días es mejor sin sales tampón.

   Generalmente, el metanol puro o el acetonitrilo solo se recomiendan para el almacenamiento a largo plazo de columnas de fase reversa, o el almacenamiento con un 80 % de fase orgánica también es una buena opción y suficiente para evitar el crecimiento bacteriano.

   Las columnas a base de CN(cianuro) son inestables en disolventes polares orgánicos y son adecuadas para el almacenamiento en frío en una fase acuosa.

6. La temperatura máxima de funcionamiento es de 60°C, la temperatura óptima es inferior a 40°C.

7. Separación de sustancias alcalinas, el valor de pH de la fase móvil utilizado debe ser una unidad por encima del PKA medido

Aplicaciones de HPLC

La HPLC se ha convertido en un método de aplicación universal y, como tal, puede utilizarse en casi todos los campos de la química, la bioquímica y la farmacéutica.

Análisis en el campo farmacéutico.

Examen de polímeros sintéticos.

Identificación de contaminantes en análisis ambientales.

Cuantificación de fármacos en matrices biológicas.

Extracción de productos valiosos.

Aseguramiento y control de calidad de productos industriales y química fina.

Purificación y aislamiento de biomoléculas como enzimas o ácidos nucleicos.

Tratamiento de agua con fines de potabilización.

Concentración de componentes traza antes del análisis.

Técnica cromatográfica que implica intercambio de ligandos.

Separación de proteínas mediante cromatografía de intercambio iónico.

Cromatografía de intercambio aniónico de alto pH de carbohidratos y oligosacáridos.

Guía de solución de problemas de HPLC

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), como instrumento altamente sofisticado, es propensa a varios problemas menores y complicados si no se utiliza correctamente durante su uso. Los problemas más comunes son la presión de la columna, la deriva y las anomalías de los picos. Por tanto, ¿cómo se soluciona rápidamente el problema ante un cromatógrafo defectuoso?

Presión excesiva

El aumento repentino de presión es el problema más común en el uso de HPLC, generalmente por los siguientes motivos:

Causas	Soluciones
Bloqueo en la ruta del flujo	Desconecte la entrada de la bomba de vacío para que el tubo de PEEK quede debajo de la botella de solvente y vea si el líquido gotea libremente. El cabezal del filtro de disolvente está obstruido si el líquido no gotea o gotea lentamente.	Remójalo en ácido nítrico al 30% durante media hora y enjuágalo con agua ultrapura. Si el líquido gotea libremente, el cabezal del filtro de disolvente está normal.
	Abrir la válvula de Purga para que la fase móvil no pase por la columna; Si la presión no baja significativamente, el cabezal blanco del filtro está obstruido.	Retire el filtro de puntos blancos y sonique con alcohol isopropílico al 10% durante media hora. El cabezal blanco del filtro es normal si la presión cae por debajo de 100 PSI. Compruébalo de nuevo.
	Retire el extremo de salida de la columna; si la presión no baja, la columna está obstruida.	Si la sal tampón está obstruida, enjuague con 95 % de agua hasta que la presión sea normal.
Configuración incorrecta del caudal	Restablecer para corregir el caudal.
Relación de fase móvil incorrecta	Reemplace con un solvente menos viscoso o restablezca la proporción.
Deriva del punto cero de la presión del sistema	Ajuste el punto cero del sensor de presión.

Una presión demasiado baja

Causas	Soluciones
Fugas del sistema	Busca las distintas conexiones, especialmente en los extremos de las columnas, y aprieta las goteras.
Aire en la bomba	Ahora la presión es a menudo inestable, alta y baja. Lo más grave será que la bomba no succione el líquido. Abra la válvula de purga y enjuague con un caudal de 3 a 5 ml/min; de lo contrario, utilice una jeringa especial para aspirar las burbujas de aire mediante una fuerza externa en la válvula de evacuación.
Sin salida de fase móvil	Compruebe si hay una fase móvil en la botella de depósito, si el sumergible está sumergido en la fase móvil y si la bomba está funcionando.
La válvula de referencia no está cerrada	Cierre la válvula de referencia después de reducir el caudal. Generalmente, reduzca a 0,1 ~ 0,2 ml/min y luego cierre la válvula de referencia.

Deriva de la línea base

Causas	Soluciones
Fluctuación de la temperatura de la columna	Compruebe que no haya ventanas abiertas ni aparatos de aire acondicionado apuntando a la cámara de temperatura de la columna.
La celda de flujo está contaminada o tiene gases	Lave la celda de flujo con metanol u otro disolvente polar fuerte (preferiblemente con la columna desconectada). Si es necesario, utilice ácido nítrico 1N (no utilice ácido clorhídrico).
Energía insuficiente de la lámpara UV	Reemplace con una nueva lámpara UV

Ruido de referencia

Causas	Soluciones
Lámpara de deuterio usada durante demasiado tiempo	La lámpara de deuterio debe reemplazarse a tiempo
Ruido de referencia (regular)	Aire en la fase móvil, detector o bomba.	Es necesaria la desgasificación de la fase móvil antes de la inyección formal; Lave el sistema para eliminar el aire del detector o la bomba.
	Fuga	Compruebe si hay accesorios de tubería flojos, fugas en la bomba, precipitación de sal y ruidos inusuales; reemplace los sellos de la bomba si es necesario
	Mezcla incompleta de la fase móvil.	Agite a mano para mezclar bien los solventes o use solventes de baja viscosidad para reducir la variación o agregue un intercambiador de calor.
	Temperatura de la columna demasiado alta	Reducir el caudal; ajustar la composición del disolvente de la fase móvil
	Otras electrónicas de la misma línea.	Desconecte otros dispositivos electrónicos que interfieren
	Vibración de la bomba	Agregue un amortiguador de pulsos al sistema si la bomba vibra
Ruido de referencia (irregular)	Fuga de líquido	Compruebe si hay accesorios sueltos, fugas en la bomba, precipitación de sal y ruidos inusuales.
	La fase móvil está contaminada, deteriorada o formada por disolventes de baja calidad.	Consulta la composición de la fase móvil.
	Los disolventes en la fase móvil no son miscibles.	Seleccionar fase móvil mutuamente soluble
	Contaminación de la celda de flujo	Limpiar la celda de flujo con ácido nítrico.
	Burbujas de aire en el sistema.	Sistema limpio con solución polar fuerte.
	Energía insuficiente en la lámpara del detector.	Cambiar lámpara
	Embalaje de columna perdido u obstruido	Reemplazar columna
	Mezcla desigual de la fase móvil.	Reparar o reemplazar mezclador

Anormalidad del patrón máximo

Causas	Soluciones
Sin picos en el cromatograma	El sistema no se alimenta o la muestra se descompone; la bomba no se infunde o la fase móvil se utiliza incorrectamente; el detector no está configurado correctamente;
Uno o varios picos son negativos	Fondo de alta absorción de la fase móvil; se introduce aire durante la inyección; La absorción de los componentes de la muestra es menor que la de la fase móvil.
Todos los picos son negativos	Cable de señal invertido o polaridad de salida del detector invertida; Óptica aún no equilibrada.
Todos los picos son anchos	El sistema no está en equilibrio; el disolvente que disuelve la muestra tiene una polaridad mucho menor que la fase móvil; elección incorrecta del tamaño y tipo de columna; la columna o precolumna está contaminada o su eficiencia se reduce; el efecto de los cambios de temperatura.
Picos más pequeños de lo esperado	La viscosidad de la muestra es demasiado alta; falla de inyección de muestra o error de volumen de inyección; configuración incorrecta del detector. Volumen incorrecto del bucle de calibración; contaminación de la celda de detección; Problemas con la lámpara del detector.
Picos dobles o picos de hombro	El volumen de inyección es demasiado grande; la concentración de la muestra es demasiado alta; la columna de protección o el cabezal de la columna están obstruidos; la muleta de protección o la columna está contaminada o fallada; la columna colapsa o forma un canal corto.
Picos previos a la extensión	Alto volumen de inyección o concentración de muestra, el disolvente que disuelve la muestra es más polar que la fase móvil; contaminación o falla de la guardacolumna o columna cromatográfica. Temperatura baja de la columna: aumente la temperatura de la columna; Elección inadecuada del disolvente de la muestra: utilice fase móvil como disolvente de la muestra; Sobrecarga de muestra: reduzca el contenido de la muestra; Columna dañada: reemplace la columna
Picos finales	1. Sobrecarga de columna: reduzca el volumen de muestra; 2. Aumente el diámetro de la columna y utilice una fase estacionaria de mayor volumen; 3. Picar la interferencia, limpiar y filtrar la muestra; ajustar la fase móvil; 4. La hidroxilación del silicio, agregar trietilamina, pasivar la columna con alcalinos aumenta la concentración de tampón o sal disminuye el pH de la fase móvil; 5. Volumen muerto o demasiado volumen fuera de la columna, minimice el punto de conexión; 6. Utilice, si es posible, un tubo de conexión con un diámetro interior fino; 7. Disminución de la eficiencia de la columna; reemplace la columna;
Picos planos	Configuración incorrecta del detector; un volumen de inyección demasiado grande o una concentración de muestra demasiado alta
Picos residuales	1. Tiempo adecuado para equilibrar y limpiar el sistema después de cada alimentación de muestra; 2. Presencia de incógnitas en la muestra, mejorar el tratamiento previo de la muestra; 3. Contaminación de la fase móvil, reemplácela con una nueva fase móvil, úsela ahora si es posible y filtre la fase móvil de la noche a la mañana cuando la use nuevamente; 4. Pequeñas burbujas de aire en el recorrido del flujo, abra la válvula de purga y aumente el caudal para eliminarlas.
Bifurcación de pico	Si la precolumna o la columna analítica está contaminada, retire la precolumna y realice un nuevo análisis. Si se considera necesario, reemplace la columna de guardia. Solvente de la muestra insoluble en la fase móvil. Cambie el solvente de la muestra; si es posible, tome la fase móvil como solvente de la muestra.
Distorsión máxima	Sobrecarga de muestra, reduzca el volumen de muestra.
Distorsión máxima temprana	1. Elección inadecuada del disolvente de la muestra. 2. Reducir el volumen de muestra 3. Uso de disolventes de muestras de baja polaridad.
Alta cola de los primeros picos	1. Efectos fuera de columna 2. Ajuste de las conexiones del sistema (usando tubos de diámetro interior más cortos y pequeños) 3. Uso de pequeños volúmenes de celdas de flujo.
Picos adicionales	1. Otros componentes de la muestra: Fenómeno normal; 2. Picos de elución de la inyección anterior: aumentar el tiempo de ejecución o la pendiente del gradiente; aumentar el caudal; 3. Picos vacíos o fantasmas: Comprobar que la fase móvil sea pura; utilizar la fase móvil como disolvente de muestra; reducir el volumen de inyección.

Conclusión

La cromatografía de gases es adecuada para aproximadamente el 20% de los compuestos orgánicos identificados, mientras que la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es necesaria para el análisis del 80% restante. La HPLC tiene las ventajas de una alta eficacia de separación, alta velocidad analítica y buena sensibilidad de detección. Es capaz de analizar y separar sustancias fisiológicamente activas térmicamente inestables y con puntos de ebullición elevados que no pueden gasificarse. En la actualidad, la tecnología de separación y análisis del sistema HPLC se ha convertido en la tecnología preferida para experimentos relevantes en los campos de la medicina, el laboratorio y la industria.