Muchos recién llegados al laboratorio a menudo se preguntan: ¿Por qué sus colegas más experimentados logran tasas de éxito tan altas con los experimentos de PCR, mientras que sus propios intentos fracasan constantemente? Aparte de las diferencias en la competencia técnica, es probable que se deba a que aún no ha utilizado un termociclador de gradiente, ese "refuerzo de la tasa de éxito".
Cómo los termocicladores de gradiente mejoran la optimización de la PCR
Existen numerosos factores que influyen en los experimentos de PCR. La Tm (temperatura de fusión) de los cebadores, el contenido de GC de la plantilla y la composición de la mezcla de reacción afectan la temperatura de reacción óptima. Un termociclador estándar solo se puede configurar a una única temperatura de recocido a la vez. Incluso una diferencia de temperatura de sólo 1 a 2 °C puede provocar un fracaso experimental.
Por el contrario, el diseño de gradiente de temperatura múltiple de un ciclador térmico de gradiente prueba eficazmente todas las condiciones de temperatura posibles en una sola ejecución, lo que aumenta naturalmente la probabilidad de encontrar las condiciones óptimas.
Un experimento para encontrar la mejor temperatura de recocido
A continuación se muestra un ejemplo práctico: si la Tm de su cebador se estima en 60 °C, utilizando un ciclador térmico estándar, puede comenzar probando a 60 °C. Si eso falla, entonces intentará con 58°C y 62°C, lo que requerirá que cada vez prepare la mezcla de reacción y ejecute el programa nuevamente. Esto no sólo lleva mucho tiempo sino que también corre el riesgo de producir resultados poco fiables debido a errores operativos.
Con un termociclador de gradiente, puede configurar directamente ocho gradientes de temperatura que van desde 56 °C a 64 °C. En un solo experimento, puedes identificar la temperatura a la que las bandas de amplificación son más brillantes y el ruido de fondo es mínimo, lo que te permite determinar las condiciones óptimas de inmediato. La tasa de éxito puede superar el 90% en una sola ejecución.
Para experimentos como la PCR multiplex, que tienen requisitos de temperatura aún más estrictos, las ventajas de un ciclador térmico de gradiente se vuelven aún más evidentes. La PCR múltiplex requiere la amplificación simultánea de múltiples objetivos utilizando múltiples pares de cebadores. Dado que la temperatura óptima varía para cada par de cebadores, es difícil encontrar una temperatura que se adapte a todos los objetivos utilizando un ciclador térmico estándar.
Por el contrario, un termociclador de gradiente puede identificar rápidamente una temperatura óptima de compromiso que permita amplificar todos los objetivos de manera eficiente, duplicando la tasa de éxito en comparación con el uso de un termociclador estándar.
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